作为最受关注的基因编辑神器，CRISPR技术的临床价值一直有待落实。但是，这一颠覆性技术的“脱靶效应”一直是阻碍其应用的关键障碍之一。近日，科学家们找到了一种预测CRISPR准确性的方法，能够有效限制其错误编辑。
CRISPR-Cas9基因编辑技术的有效运行依赖于Cas9酶在特定目标位点切割DNA。但是，这一技术却面临着“脱靶”的风险，即Cas9酶可能会在错误的位置剪切。我们都知道，编辑了“预想之外”的基因，很有可能会带来不可预控的严重后果。
通常，我们检测非靶标突变（off-target mutations）的方法是：先利用计算机算法预测出最可能被“错误击中”的区域，然后再检查这些“危险区域”的缺失和插入情况。
9月12日，《Nature》期刊最新发表一篇题为“In vivo CRISPR editing with no detectable genome-wide off-target mutations”的研究，揭示了一种预测基因组编辑中“错误突变”的新策略，并在小鼠试验中证实精心设计的引导RNA链不会产生任何可检测到的错误突变。
“脱靶效应”有多严重
非靶向剪切可能发生在对生物功能没有影响的基因组位置，也可能会破坏细胞的基本功能。通常，研究人员会利用计算机程序进行预测，但是这些预测依赖于引导RNA如何与DNA结合以及Cas9如何切割的假设。
2017年5月，《Nature Methods》期刊曾发表一篇文章，揭示CRISPR能够引入数百种意想不到的突变。他们发现，CRISPR确实能够成功纠正引发失明的基因，但两只接受了基因治疗的小鼠的基因组中存在超过1500个单核苷酸突变以及超过100处更大片段的缺失和插入。需要强调的是，这些DNA突变都没有被计算机算法预测出来。
虽然错误概率远超我们的认知，但是我们依然缺乏一种能够准确预测CRISPR非靶标编辑的方法，这意味着，目前我们还不清楚这些预测突变是否会发生以及发生的频率如何。
最新研究：引导RNA 是关键
文章作者、瑞典阿斯利康公司的生物学家Marcello Maresca表示，公司的一个长期目标是能够使用基因编辑技术治疗一些人类疾病。“然而，要想实现CRISPR药物的潜力，就需要开发出一种方法，能够让目标基因得到有效修饰，且基因组其他位置不受影响。”
在这项新研究中，Maresca团队与哈佛大学和麻省总医院的生物学家、病理学家J. Keith Joung课题组合作，开发了一种“体内非靶点验证”的方法（verification of in vivo off-targets，VIVO），可以稳定地鉴定出CRISPR在体内全基因组中的脱靶效应。
首先，他们以小鼠基因组为研究对象，在体外将其DNA剪切成片段，每个片段约包含300个碱基对，然后连接一系列使DNA形成闭环的“接口”（adapters）。随后，他们引入一个Cas9核酸酶和引导RNA复合体，它们会在环状DNA的一些位点上进行切割，使其线性化。最后，研究人员会添加另一批核酸酶，负责降解剩余未被剪切的闭环DNA。
通过这一系列步骤，研究人员可以对线性化的DNA进行测序，以检测Cas9在哪些位置进行了切割（无论是有意的还是无意的），同时预测引导RNA是否会在体内引发脱靶效应。
以上体外验证工作是J. Keith Joung团队于2017年完成的工作（发表在《Nature Methods》期刊）。现在，他们将成果转移至体内：利用一引导RNA（在体外预测中，发现其会在基因组中造成数千个错误剪切位点）进行小鼠体内试验。结果显示，超40%的预测位点在小鼠肝脏中确实发生了突变。
而且，在体外预测中，一个位点出现的频率越高，它在体内发生突变的可能性就越大。换句话说，引导RNA在体外是“粗心”的，在体内肯定也是粗心的。
研究团队还检测了小鼠体内试验中基因组上的特殊位点——这些点在计算机预测中都属于可能的脱靶位点，但是在体外试验中并没有出现——结果发现，在体内试验中这些位点并没有出现突变。这意味着，体外试验并没有错过真正的非目标剪切。
更重要的是，他们证实，设计对靶点高度特异性的引导RNA，可以有效指导小鼠肝脏细胞的基因编辑，且不会出现可检测到的非靶向突变。
这项研究证实“你最好确保有一个真正准确的引导RNA”，多伦多大学的发育生物学家Janet Rossant表示，“这项研究的突破性在于，VIVO能够检测出细胞特定的非靶标突变，而不是依赖于参考基因组序列（不一定能够反映你所研究的有机体的遗传背景，或者在临床应用中患者的遗传背景）。由于可以针对来自于患者或者特定有机体的基因组DNA在体外进行筛选，因此测序步骤的读取结果反映了受试者基因组中可能的Cas9目标。”
参考资料：1）New Technique Limits CRISPR-Cas9 Off-Target Mutations
2）泼冷水！Nature子刊“大发现”：CRISPR可引发数百种“意外突变”！
3）In vivo CRISPR editing with no detectable genome-wide off-target mutations